在细胞培养的过程中，总是能遇到这样的问题——细胞中有小黑点，一些难消化长得慢的细胞总会出现黑点，还有一些有漂浮的死细胞，崩解之后形成黑点和碎片，但还有一些是霉菌或细菌真菌类的污染也会形成小黑点，小黑点对细胞状态和实验效果等都有影响，怎么区别小黑点是细胞碎片，细胞核还是细菌等污染呢？

 

 

 

先让我们来看看细胞遭受小黑点入侵后的灾难现场~

 

小黑点之所以这么令人头痛，是由于它的数量会随着培养时间的增加而不断增加，当数量多到一定程度的时候，就会对细胞的生长造成一定的影响，严重影响科研的进展。在显微镜下观察时往往表现为没有光泽，体积较小的黑色颗粒。

 

下面小编跟大家分享下培养细胞过程中碰到过的小黑点。

  一、细胞碎片

化学或物理的强烈刺激（例如胰酶消化时间过长，吹打细胞太过用力等）往往会导致细胞死亡，产生很多的细胞碎片。在显微镜下进行观察时，可以看到很多呈不规则形态、没有光泽的颗粒粘附在细胞培养皿的底部。

 

建议：状态不好的细胞往往贴壁能力较强，因此切勿用移液器进行强力的吹打，从而损害了健康的细胞；另外，控制好胰酶消化的时间，只需要保证大部分正常的细胞被消化下来就可以了，然后更换新的细胞培养皿。

  二、凋亡小体

体外培养的动物细胞很容易受到培养环境因素的影响，例如营养成分的改变、氧的供给、毒素、细胞代谢产物的积累、pH、 剪切力、细胞密度及微生物污染等。这些环境的改变都有可能诱发细胞的凋亡，从而产生很多分泌的凋亡小体。凋亡小体大多游离在培养基中，但也有一些会通过暴露的核酸彼此之间相互黏连，从而形成一个棕色的凋亡小体团块，没有细胞光泽。

 

建议：细胞培养的过程中一定要控制细胞传代的时间，不能让细胞“长过”；不要使用过酸或者过碱的培养基进行细胞培养；选用内毒素含量较低的血清。

  三、血清中的沉淀

磷酸钙是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

 

建议：经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著增多，对于大多数的细胞而言是不需要进过高温灭活处理的。

  四、黑胶虫

对于细胞培养过程中的小黑点到底是什么，目前呼声最高的非黑胶虫莫属，但是小编查看了很多的资料，依旧不知道其为何方神圣。有人认为是从血清中来的一种原虫，有人认为是细菌，或是真菌，也有人认为是血清中的蛋白结晶，因此消灭黑胶虫的方式也是各式各样。

 

建议：如果污染的细胞数量不是很多，建议直接丢弃，或者重新复苏细胞进行培养。

  五、支原体污染

黑胶虫的污染很难定性，大部分被黑胶虫污染的细胞都存在生长迟缓，培养基颜色没有明显改变的现象，更像是受到了支原体的污染。已有通过使用支原体去除试剂解决黑胶虫污染困扰的成功案例，为此Yeasen公司特别研发了针对支原体污染的一系列产品，包括支原体的检测，支原体去除，以及去除后防止支原体再度感染的支原体预防试剂。

一旦您在细胞培育的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培育基是否混浊，然后，在镜下观察培育细胞生长的 状态，黑点是否游动。假如细胞被污染，微生物则会大量繁衍，培育基就会迅速变黄、变混浊。污染包含细菌污染、 支原体污染等。

  假如在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点呈现前相比。没有任何变化，那么，黑点的呈现可能与以下几种状况有关：

1、细胞生长过老，破碎的细胞残骸;

2、血清质量不好，反复冻融的成果;

3、制造培育基的pH值偏高，不宜细胞生长;

4、制造培育基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点;

5、培育原代细胞中呈现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。

  细胞培育中怎么防止黑点生成?

1、尽可能地减少血清冻融次数。

2、培育基无需37℃水浴。

3、培育基坚持最佳PH值7.0- 7.2。

4、严格控制制造培育基的水质，容器定时刷洗。

5、掌握细胞传代的最佳时机，细胞切勿生长过老。